1600年5月18日(萬歷二十八年)，利瑪竇帶著龐迪我(DidacedePantoja)神父和準備好獻給皇帝的禮物再度赴京，并于1601年1月24日抵達北京。進呈自鳴鐘、圣經、《萬國圖志》、大西洋琴等方物，得明神宗信任。

同年，明神宗下詔允許利瑪竇等人長居北京。但中國的朝廷根本沒有注意到，利瑪竇長住北京的目的是為了傳播基督教。之后利瑪竇在北京以豐富東西學識，結交中國的士大夫。常與賓客談論天主、靈魂、天堂、地獄。同時編撰新書，包括以中文寫成的《二十五言》等，得到不少中國知識分子的尊重。

到了1605年，北京已有200人信奉天主教，當中有數名更是公卿大臣。這當中最著名的，也是后來影響最大的是進士出身的翰林徐光啟。

1610年5月11日(萬歷三十八年)利瑪竇病逝于北京，賜葬于平則門外的二里溝。逝世前指定龍華民(NicolasLonglbardi)接任教會中職務。

利瑪竇(MatteoRicci，1552年10月6日—1610年5月11日)，意大利的耶穌會傳教士，學者。1583年(明代萬歷年間)來到中國居住。其原名中文直譯為瑪提歐·利奇，利瑪竇是他的中文名字，號西泰，又號清泰、西江。在中國頗受士大夫的敬重，尊稱為“泰西儒士”。他是天主教在中國傳教的開拓者之一，也是第一位閱讀中國文學并對中國典籍進行鉆研的西方學者。他除傳播天主教教義外，還廣交中國官員和社會名流，傳播西方天文、數學、地理等科學技術知識。他的著述不僅對中西交流作出了重要貢獻，對日本和朝鮮半島上的國家認識西方文明也產生了重要影響。